等電聚焦凝膠電泳是依據(jù)蛋白質(zhì)分子的靜電荷或等電點(diǎn)進(jìn)行分離的技術(shù)，等電聚焦中，蛋白質(zhì)分子在含有載體兩性電解質(zhì)形成的一個(gè)連續(xù)而穩(wěn)定的線性pH梯度中電泳。載體兩性電解質(zhì)是脂肪族多氨基多羧酸，在電場中形成正極為酸性，負(fù)極為堿性的連續(xù)的pH梯度。蛋白質(zhì)分子在偏離其等電點(diǎn)的pH條件下帶有電荷，因此可以在電場中移動(dòng)；當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)遷移至其等電點(diǎn)位置時(shí)，其靜電荷數(shù)為零，在電場中不再移動(dòng)，據(jù)此將蛋白質(zhì)分離。
等電聚焦中，只有在凝膠兩端給以高電壓時(shí)，才能獲得較好的蛋白質(zhì)條帶分辨率，這就需要非常有效的凝膠冷卻系統(tǒng)（否則會(huì)導(dǎo)致燒膠），即凝膠同期周圍液體之間的熱傳遞效率要高。由于平板膠熱傳遞能力高，并可方便的同時(shí)比較多種蛋白質(zhì)樣品，所以平板膠用在等電聚焦上的居多。
由于等電聚焦對蛋白質(zhì)的電荷差異非常敏感，若要好的重復(fù)性，制備蛋白樣品時(shí)一定要小心，要避免任何對蛋白質(zhì)化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)的修飾。另外，蛋白質(zhì)－脂類、蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用可引起電荷改變，進(jìn)而導(dǎo)致等電點(diǎn)遷移或紋理現(xiàn)象。除非特殊需要研究蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用或者必須保持蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能，等電聚焦通常在含有尿素的變性凝膠系統(tǒng)中進(jìn)行。使用非離子去垢劑也可以提高分辨率。
等點(diǎn)聚焦實(shí)驗(yàn)的缺點(diǎn)主要是要求使用無鹽的溶液，而蛋白質(zhì)在這種溶液中會(huì)發(fā)生沉淀作用，等電點(diǎn)試驗(yàn)蛋白樣品中的成分要停留在其各自的等電點(diǎn)位置，因此對于在等電點(diǎn)不溶或者發(fā)生變性的蛋白質(zhì)中不太適合。
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